Test RT-PCR como herramienta para identificar presencia de Sars-Cov-2, infectividad y virulencia

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Médicos por la Libertad Chile

Octubre, 2020

Resumen

Este artículo pretende mostrar ejemplos de la revisión que se ha hecho como agrupación. Son numerosos los artículos que se han revisado, tanto en la efectividad e inefectividad del test RT-PCR para determinar presencia viral y como herramienta de diagnóstico; acá mostraremos un resumen de esta revisión para poder dar con un veredicto más claro y fundamentado.

Introducción

Existen diversas técnicas de recopilación de material genético para su posterior análisis. Entre ellas está la técnica de reacción en cadena de polimerasa (PCR), la cual a su vez, tiene varias sub técnicas (sencilla, anidada, retro transcripción, múltiple, tiempo real, msp, digital y distintas formas de secuenciación) (1). Esta técnica se utiliza desde el año 1985 por su creador, Cary Mullis, para poder trabajar mejor sobre material genético que es difícil de visualizar con equipamiento simple de laboratorio. Se le ha atribuido una utilidad para determinar presencia de elementos virales, atribuyéndole la capacidad de diagnosticar enfermedad.

De esta forma, llegamos a la fecha en que nos encontramos con otra gran pandemia de virus respiratorio, en donde se han tomado decisiones y medidas para intentar frenar la propagación del virus Sars-Cov-2, en base a un solo test. Se ha propuesto usar, para esta pandemia, la PCR en tiempo real por retro transcripción (RT-PCR), debido a que se señala como la más fácil, rápida y certera.

A continuación revisaremos evidencia al respecto de la efectividad del test RT-PCR, sus aplicaciones reales y los niveles jerárquicos de evidencia que presentan diferentes estudios.

Figura 1.

Especificaciones técnicas

Siendo una prueba molecular para detectar ácido nucleico, su especificación es generar una alta cantidad de copias de este material genético que esté presente en la muestra de tejido o fluido que se esté analizando En particular, la detección de ácidos nucleicos o ARN viral de la influenza por medio de estos ensayos moleculares no siempre indica la viabilidad del virus o la continua replicación viral de la influenza (2).

Aunque esta técnica se considere como el “estándar dorado” para la detección de ácido nucleico, está lejos de serlo. Hay problemas significativos causados por la variabilidad de plantillas de ARN, diseño de ensayos y protocolos, además de la inapropiada normalización de los datos e inconsistencia en el análisis de estos, son ampliamente conocidos pero también ignorados. No hay que olvidar que la RT-PCR ofrece una foto instantánea de la información correspondiente a la cantidad de la transcripción en una célula o tejido (3).

Forma de evaluar

Se desarrollaron cinco paneles para la detección del Sars-Cov-2 provenientes de la CDC de China, el instituto Charité de Alemania, la Universidad de Hong Kong, el Instituto Nacional de Salud de Tailandia y la CDC de EEUU. Estos paneles dicen que es lo que cada ensayo debe buscar. Cada ensayo vendría siendo una “receta” específica con la cual se preparó todo el material (desde la extracción hasta la interpretación) para trabajar sobre las muestras recolectadas. Así, nos encontramos con muchos ensayos o recetas que ocupan los diferentes laboratorios, no habiendo una estandarización de estos.

¿Qué detectan los ensayos de cada panel?

En cada uno de estos paneles, se busca la detección de diferentes fragmentos del virus. Específicamente se buscan los genes ORF1ab, N, E y RdRP, en distintas combinaciones. Por ejemplo, el ensayo elaborado por Allplex apunta a encontrar los genes E, RdRP y N (4). De esta forma, si un caso arroja positivo en la detección de cualquiera de estos genes o sus combinaciones, el resultado final será positivo. El gran problema con esto, es que el gen E es 100% homólogo para los demás sarbecovirus, por lo que marcará positivo ante la presencia de cualquiera de esto, y el resultado final marcará positivo, ya que el panel así lo permite y especifica.

Figura 2.

Test de contraste: Cultivo celular

Diversos autores concuerdan que una de las maneras más efectivas de comprobar si el resultado del test RT-PCR es verídico, es contrastarlo la muestra analizada en un cultivo celular in vitro (5) (6) (7).

En el pasado, el cultivo celular se ha utilizado como test de contraste para detección de diversos virus y a pesar de que aun haya pocos estudios de contraste por cultivo celular para corroborar la precisión del test qRT-PCR, la evidencia es congruente con la experiencia del pasado.

La ventaja fundamental del cultivo celular es la confirmación de la viabilidad y la infectividad del virus y la diferenciación entre virus capaces de infectar e incapaces de hacerlo. Esta información no es posible obtenerla con los métodos de amplificación molecular y los métodos antigénicos de detección viral (8).

Ciclos de corte

Existe una especificación técnica clave, que es el número de ciclos por los cuales se replica el material genético. Se definen cortes de ciclo para determinar si un resultado es positivo o negativo, es decir, es decir, si la fluorescencia (que es la que señala presencia del virus) aparece dentro de un número específico de ciclos de replicación.

Cabe señalar la Universidad de Oxford, a través de su Journal de Clinical Infectious Diseases (CID), ha determinado que los ciclos máximos de confiabilidad para determinar presencia de virus replicable y capaz de transmitirse, son no más de 24 ciclos de replicación (5). Por lo tanto, si se trabaja con equipos que utilizan rangos sobre los 35 ciclos (ensayos que utilizan las clínicas actualmente), ya se produce un rango de confiabilidad extremadamente bajo, resultando en incalculables falsos positivos. La diferencia de 1 sólo ciclo de replicación muestra que las probabilidades de que el cultivo de virus de esa muestra sea positivo, disminuye un 33%, es decir, si se fuerza buscar fluorescencia, cada ciclo que se añada, va a ser menos probable que esa carga viral tenga capacidad de infección (propagación del virus).

Hay poca información sobre qué panel ocupa cada país o si todos los laboratorios del mismo país, ocupan el mismo panel y protocolos. ). Por ejemplo, en Santiago, en la Clínica de San Carlos de Apoquindo, se utiliza un equipo marca Sciencell, el cual tiene una variación de Ciclos de corte para positivo/negativo (Ct) entre 36 y 40; por su parte, la clínica Alemana utiliza equipos ABI 7500/Applied Biosystems o CFX96/Biorad, los cuales trabajan con ciclos <35 positivo y >40 negativo. Habiendo variaciones en los equipos que utilizan, ya producirá variaciones en los resultados, como lo muestran estudios de comparación de diferentes equipos de RT-PCR (9) (10).

Efectividad Real

Baja precisión e inefectividad

De los registros más importantes que tenemos para revisar, es el Panel de Diagnóstico con qRT-PCR para el 2019 Novel Coronavirus (2019-nCov). En este documento, en la parte de Performance clínico muestra que del total de resultados positivos, sólo un 34,7% fueron positivos verdaderos, después de someterse a contraste por cultivo celular (11).

Últimos estudios de la CDC

Se ve concluyentemente que los las muestras analizadas que son mayores a 8 días desde que aparecen los síntomas, no es posible encontrar virus replicable, en los casos de síntomas leves. Incluso se ha recuperado material genético después de 67 días, sin que estos muestren positividad en cultivo celular (12).

Figura 3.

Sólo los puntos rojos muestran cultivo positivo y presencia de material genético replicable del virus (no solo rastros de material genético).

Limitaciones

Sensibilidad

Al ser un test ultra sensible, el más mínimo error va a alterar los resultados. Esto puede ir desde una mala manipulación del kit de extracción y transporte, y esto toma especial relevancia cuando vemos que se utilizaron más de un millón de kits que presentaron problemas por incompatibilidad con sistemas universales de extracción y transporte, produciendo manipulaciones indebidas para poder transportar dichas muestras (13). Hasta incorrectos nucleótidos incorporados por la polimerasa. Además de que puede detectar secuencias parecidas a los primers, pero que no sean completamente idénticas (14), lo cual confirmaría la tan temida contaminación cruzada, es decir, la detección de otros virus.

Correlación con infectividad y virulencia

Además, si llegara a detectar correctamente la presencia del virus SARS-Cov-2, esto no implica que esos rastros de material genético sean capaces de contagiar (15) porque este test no está hecho para detectar material replicable del virus, solo detecta rastros de su material genético. A esto se le suma que este test no puede determinar si la presencia de ARN viral implica la presencia de virus infeccioso o de que este fuera responsable de los síntomas clínicos del paciente. Al igual que no puede determinar si dichos síntomas son causados por otro virus o bacteria (11).

Así, la relación entre test positivo de RT-PCR no se ha podido relacionar con la capacidad de contagiar el virus o de que este virus esté activo y sea capaz de causar daño al portador (6).

Discusión

La fuerte evidencia muestra que el test qRT-PCR no es un test que arroje evidencia sólida para usarse como método de diagnóstico del virus Sars-Cov-2:

  1. No correlaciona presencia de material genético con capacidad de transmisión de este material (infecciosidad); es decir, no hay prueba de que pueda pasar de un individuo a otro por alguna de las vías descritas.
  2. No correlaciona presencia de material genético con virulencia (efecto citopático), es decir, la capacidad de generar problemas, síntomas o clínica en el individuo.
  3. Un test “positivo” no significa que el individuo este contagiado ni enfermo.
  4. No hay una estandarización en cuanto a paneles, ensayos ni equipos utilizados a nivel mundial y nacional.
  5. Presenta una efectividad real muy baja, contrastado por exámenes de cultivo celular (34,7% de acuerdo a los estudios de la CDC de Estados Unidos)

Para que esta estrategia hubiera tenido un mayor grado de éxito, se tendría que haber estandarizado el uso de un solo tipo de kit de extracción, un solo modelo/marca de equipo de PCR, un solo panel de detección, y un solo ensayo a seguir. Además de esto, cada test se tendría que haber contrastado con cultivo celular para determinar el grado de veracidad del resultado. Siendo esta línea de acción, una imposibilidad logística, la estrategia estuvo condenada al fracaso desde un inicio. Sobre todo porque se usó como único medio para diagnosticar y elaborar medidas de contingencia en base a datos arrojados, produciendo un error fatal en el manejo de la pandemia.

Afiliación

Parte del grupo Médicos por la Libertad Chile, organismo independiente sin afiliaciones políticas ni financieras.

Financiamiento

Ninguno.

Conflicto de interés

Se declara no tener conflictos de interés.

REFERENCIAS:

  1. Cigudosa, D. J. (29-30 de Mayo de 2014). Sociedad Española de Anatomía Patológica. Obtenido de Conceptos básicos sobre ADN y ARN, Técnicas de amplificación (PCR y variantes), Aplicaciones principales: https://www.seap.es/c/document_library/get_file?uuid=27b6b558-aed1-4586-8b3d-8754cf2fc83d&groupId=10157
  2. CDC. (21 de Octubre de 2019). Centro para el control y la prevención de Enfermedades,. Obtenido de https://espanol.cdc.gov/flu/professionals/diagnosis/molecular-assays.htm
  3. Nolan, T., Hands, R. E., & Bustin, S. A. (2006). Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nature protocols1(3), 1559–1582. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.236
  4. Technology, S. S. (4 de 2020). Allplex 2019 nCov Assay. Obtenido de http://www.seegene.com/upload/product/IFU_FDA_COVID19_Seegene.pdf
  5. Bullard, J., Dust, K., Funk, D., Strong, J. E., Alexander, D., Garnett, L., Boodman, C., Bello, A., Hedley, A., Schiffman, Z., Doan, K., Bastien, N., Li, Y., Van Caeseele, P. G., & Poliquin, G. (2020). Predicting infectious SARS-CoV-2 from diagnostic samples. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America, ciaa638. Advance online publication. https://doi.org/10.1093/cid/ciaa638
  6. Sergio Santos, M. C. (23 de Septiembre de 200). CEBM. Obtenido de PCR positives: what do they mean?: https://www.cebm.net/covid-19/pcr-positives-what-do-they-mean/
  7. Tom Jefferson, Elizabeth Spencer, Jon Brassey, Carl Heneghan. Viral cultures for COVID-19 infectivity assessment. Systematic review medRxiv 2020.08.04.20167932; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.04.20167932
  8. Eiros, J. M., Ortiz de Lejarazu, R., Tenorio, A., Casas, I., Pozo, F., Ruiz, G., & Pérez-Breña, P. (2009). Diagnóstico microbiológico de las infecciones virales respiratorias [Microbiological diagnosis of viral respiratory infections]. Enfermedades infecciosas y microbiologia clinica27(3), 168–177. https://doi.org/10.1016/j.eimc.2008.03.004
  9. Salez, N., Vabret, A., Leruez-Ville, M., Andreoletti, L., Carrat, F., Renois, F., & de Lamballerie, X. (2015). Evaluation of Four Commercial Multiplex Molecular Tests for the Diagnosis of Acute Respiratory Infections. PloS one10(6), e0130378. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0130378
  10. Dabisch-Ruthe, M., Vollmer, T., Adams, O. et al. Comparison of three multiplex PCR assays for the detection of respiratory viral infections: evaluation of xTAG respiratory virus panel fast assay, RespiFinder 19 assay and RespiFinder SMART 22 assay. BMC Infect Dis 12, 163 (2012). https://doi.org/10.1186/1471-2334-12-163
  11. CDC, C. f. (13 de July de 2020). FDA. Obtenido de Panel de Diagnóstico con qRT-PCR para el 2019 Novel Coronavirus (2019-nCov): https://www.fda.gov/media/134922/download?fbclid=IwAR1DdEweazD3ixmrpZMc07VXM0_n1qx455rGV7E0fAEcA1QZf3Peh0Qxypo
  12. Perera, R., Tso, E., Tsang, O., Tsang, D., Fung, K., Leung, Y….Peiris, M. (2020). SARS-CoV-2 Virus Culture and Subgenomic RNA for Respiratory Specimens from Patients with Mild Coronavirus Disease. Emerging Infectious Diseases, 26(11), 2701-2704. https://dx.doi.org/10.3201/eid2611.203219.
  13. Nicolás Sepúlveda, C. A. (19 de Abril de 2020). CIPER. Obtenido de Chile compró un millón de kits para exámenes de Covid-19 y laboratorios cuestionan su eficacia: https://www.ciperchile.cl/2020/04/19/chile-compro-un-millon-de-kits-para-examenes-de-covid-19-y-laboratorios-cuestionan-su-eficacia/
  14. Garibyan, L., & Avashia, N. (2013). Polymerase chain reaction. The Journal of investigative dermatology133(3), 1–4. https://doi.org/10.1038/jid.2013.1
  15. Mahase Elisabeth. Covid-19: the problems with case counting BMJ 2020; 370 :m3374. https://www.bmj.com/content/370/bmj.m3374